单周转率主动荧光测定法（STAF）监测浮游植物大时空尺度上

植物初级生产力约占全球碳固定的一半。目前初级生产力的测量方法主要为两种：

卫星遥感：

在尽可能广泛的空间和时间尺度上运作

测量的PhytoPP误差较大

14C示踪法

最广泛使用的直接评价PhytoPP方法

操作的空间和时间尺度有限，导致极端欠采样

Chelsea Technologies的LabSTAF系统是在NERC资助的OCEANIDS计划（NE/P020844/1）中开发的。开发下一代更小、更节能、可部署的STAF系统在欧盟资助的海洋传感技术（TechOceanS）方案内仍在继续进行。我们目标是发展以STAF为基础的工具和方法来评估PhytoPP，与使用14C示踪剂方法相比，可以在更宽的空间和时间尺度上实现PhytoPP，并具有相当的准确度和精密度。

本文的目的是概述STAF荧光仪系统作为在空间和时间尺度上测量PhytoPP的平台，大大缓解了现有的采样不足问题。

目标平台包括：

科考船上的实验室及航行系统（LabSTAF）
大型自动驾驶平台，包括AutoSub LR和AutoNaut（AutoSTAF）
小型自主平台、滑翔机及Argo浮标（下一代STAF测量系统）

对于PhytoPP评估：

所有STAF系统的高动态范围（从极端寡营养到中营养）
高度自动化，基于STAF的PSII光化学通量（mol electrons m ^-3-3 s^-1）测量
通过14C固定验证的STAF方法（mol C m^-3-3 s^-1）

总体目标：

尽量减少使用STAF生成 PSII光化学通量值时产生的误差
  增加我们对决定因素Φ^e,C 的理解

STAF基础测量

图1  所有的STAF仪器都采用了单周转（ST）方法，通常使用100 μs的LED 脉冲来使PSII光合作用达到饱和。被测量的样品体积小于总量的5%（10~20 ml）。被动式样品交换允许高测量频率，并在极端寡营养条件下提供高质量的数据。

在图1中，F _v 是 “可变”荧光。F_o 和F_m分别是可变荧光的“初始 ”和“最大”荧光水平。σPII是PSII光化学的吸收横截面。在光照照射下，分别相当于Fq'、F'、Fm'和σPII'。尽管没有单位，但所有由STAF系统报告的荧光（F）值都是在校准的基础上。报告的σPII值单位为nm    ^-2 PSII^-1。

FLC生成rP-E曲线

荧光光曲线（FLC）包括在黑暗和饱和光之间的几个光合辐照度水平上进行的一组自动STAF测量。FLC生成的数据集可与基于14C示踪剂的光合作用光子辐照度（P-E）曲线相媲美。

图2 第一步数据处理生成相对光合作用光子辐照度（rP-E）曲线，其中rP值为入射光子辐照度与PSII光化学效率（ΦPII'）的乘积。无量纲ΦPII'的值由Fq'/Fmc'算出。这里的报告rP单位为µmol photons m-2 s-1，表示PSII光化学通过1 m2σPII'的速率。

Fmc'中的“c”下标表示已应用基线校正（参见校正要求）。

一系列其他的STAF衍生的参数是由RunSTAF在FLC层面产生。在这个例子中，Fm'和τt'是由rP绘制。Fm'的下降通常伴随了PSII光化学的下调情况。τt' 时间常数跟踪PSII光化学的周转时间，报告单位为µs。

每PSII或每单位体积光化学通量

假设每个PSII光化学事件导致一个电子从氧转移到质体醌，rP的SI单位为mol electrons m-2 s-1。STAF系统允许将rP值转换为PSII光化学通量。每PSII光化学通量的SI单位为electrons PSII-1s-1，定义为JPII。每单位体积（海洋或其他介质）的光化学反应的SI单位为mol electrons m-3 s-1，定义为JVPII。RunSTAF采用Sigma方法生成JPII的报告值（公式1），采用吸收法生成JVPII报告值（公式2）。

Sigma方法和吸收法

图3  Sigma方法可以从STAF数据中提供JPII（electrons PSII-1 s-1），不提供JVPII（mol electrons m-3 s-1）。将Sigma衍生的JPII转换为JVPII需要独立评估光化学活性浓度PSII m-3（图中以红色显示）。虽然吸收方法可以直接从STAF数据中提供PSII m-3，但将该值代入Sigma方程使其与吸收方程完全等价（包含的σPII值抵消了）。

校正要求

生成JPII和JVPII值需要光谱校正。生成JVPII还需要对包装效应进行校正（图5），并对基线荧光进行评估（图6）。谱校正需要精确测定用于提供ST测量脉冲和光化光LED的光子通量和光谱输出，以及样品的光化学激发曲线(PEP)，打包效应校正是通过双波段测量最大和最小重吸收的荧光发射（10 nm半带宽，集中在685 nm和730 nm）来实现的。基线荧光校正适用于光失活PSII复合体积累导致的Fv/Fm测量值较低的情况。

使用PEP进行光谱校正

PEP的主要作用是便于对JPII和JVPII进行光谱校正。PEP数据是使用LED测量波段的不同组合产生的。RunSTAF由这些不同组合的ST曲线计算Fv和σPII值。Fv用于光谱校正。虽然生成PEP在技术上具有挑战性，但该过程是完全自动化的，通常不需要超过两分钟的测量。

图4  一个PEP曲线包括了416~622 nm的光谱。光谱校正光谱（SCS）的范围将Fv PEP扩展到380~660 nm之间。上部图中的红线显示了天然淡水样本的扩展PEP。LabSTAF内的光化LED的发射光谱显示为蓝色。图中还包括了七个LED测量波段的发射光谱。上部图中黄色虚线显示的是来自光化光源的一个发射光谱。添加此功能是为了方便比较STAF与14C固化平行测量的数据。在下部图中，来自光化光源的光谱已应用于LabSTAF数据集（应用ESD）。这将触发所有受影响参数值的重新计算，包括αLHII和Ek。αLHII的变化与JVPII是呈正比的（见公式2）。

打包效应修正

图5  使用STAF测量，荧光发射通常在685 nm测量。这为光化学活性PSII配合物和其它源的发射提供了最大的光谱区分。缺点是PSII对荧光发射的重吸收在该波段内接近最大值。在这个波段内，实际的重吸收水平取决于单个细胞的光学特性（封装效应）。在685 nm和730 nm测量的Fv的比率可以用来校正封装效应。通常，完全自动化的包装效果校正需要不超过30秒。

基线校正

图6  在此例中，ST脉冲应用于暗适应样品产生的Fv /Fm为0.382，这明显低于从“健康”暗适应细胞中广泛看到的0.5至0.65范围。这个较低的值可能是PSII光化学被抑制的结果，或者可能表明除了光化学活性的PSII复合体（包括光失活的PSII复合体）以外的其他来源的高水平荧光与在健康范围内的内在PSII光化学效率相结合。公式3可用于计算在假定的本征Fv /Fm（公式中的Fv /Fmc项）上的基线荧光（Fb）。

JVPII与14C固定的直接比较

需要对JVPII和14C固定进行平行测量，以了解控制它们之间可变比例的因素。迄今为止，方法上的不一致，包括孵育长度和光质量的差异，极大地抑制了电子碳比的实际评估（Φe,C值）。图7中的图像显示了LabSTAF单元用于运行JVPII和14C固定的“双重孵育”测量。LabSTAF内置的相对较大的样品室（25mm内径和56mm高度）便于进行此测量。14C加标样品包含在闪烁瓶（23毫米外径）。除了为两个测量提供单一的光化光源外，这种安排还允许在整个14C 的孵育期内进行STAF测量。

图7 LabSTAF内的大样品室允许使用闪烁小瓶，以方便使用单个光化光源（双孵化）平行测量JVPII和14C固定。左边的图是在北大西洋用天然浮游植物组合进行的一组双重孵化。 在这个示例中，Φe,C的范围从大约5到略高于7。这个范围比在以前的实验中观察到的要小得多，在以前的实验中，STAF评估率和14C评估率是并行测量的，而不是同时测量的。JVPII值包括RunSTAF软件中用于运行系统和处理数据的自动光谱和打包效应校正。

光化学激发光谱（PEP）

如上所述，PEP的应用是为了促进JPII和JVPII的光谱校正。RunSTAF计算Fv和σPII的波段特定值。虽然Fv PEP值在很大程度上不受样品内光谱异质性的影响，但σPII PEP值则不是。因此只有Fv PEP值用于校正JPII和JVPII。

图8  PEP是通过平均用户设置的ST曲线数的每个组合波段来构建的。LabSTAF或AutoSTAF单元循环Steps列表，直到获得所需数量的曲线为止。使用LED的最佳组合可确保在ST脉冲期间关闭足够高比例的功能PSII复合体，以产生准确的Fv和σPII。

图9  10种浮游植物的代表性PEP + ST脉冲曲线。提供了一些Fv和σPII PEP示例。例子E和J显示了两种PEP之间最大的差异，并且可能包括蓝藻污染。

基线荧光

不来自于光化学活性PSII复合体的Fo部分被称为基线荧光，并被量化为Fb。基线荧光在包括JVPII在内的许多荧光参数的计算中引入了误差。图10中的数据图说明了基线校正对STAF衍生的PSII光化学评估与Clark型电极测量的总氧释放之间匹配的影响。

图10  氧光曲线（OLC）和荧光光曲线（FLC）同时测量一系列浮游植物物种。在~ 20 °C和30 µmol photons m−2 s−1的培养物上进行测量。FLC数据被标准化为O2的等效单位，OLC和FLC数据归一化为衍生的功能PSII复合体的浓度（O2 PSII−1s−1）。FLC数据使用KaFO（11800 m−1）或样品样本特异性（KaS）值获得。实线表示P-E曲线拟合。KaS值是通过对所有物种应用内在的Fv/Fm（Fv/Fmc）0.518生成的（公式4）。这些数据原发表于Boatman et al. 2019。

双ST脉冲测量

双ST脉冲（DSP）方法结合在这里描述的STAF系统中，跟踪序列第一个ST脉冲中关闭的PSII复合体的重新开放。ST脉冲通常具有相同的持续时间，它们之间的间隔是可变的（图11）。